1. Hvis jeg modtager et rør med frosne celler, kan jeg så putte det direkte i flydende nitrogen til opbevaring?
I mange tilfælde kan celler transporteret på tøris (-80°C) sættes tilbage i flydende nitrogen og derefter optøs hurtigt bagefter.Cellelevedygtigheden kan dog være reduceret efter en sådan behandling.For nogle følsomme cellelinjer kan dette gøre cellegendannelse vanskeligere.Dette fænomen menes at skyldes en ændring i strukturen af iskrystallerne i cellerne som følge af temperaturændringen.Det anbefales derfor, at celler optøs og dyrkes hurtigst muligt efter modtagelsen.Reducer opbevaringstiden ved -80°C.Denne temperatur bruges kun til transport.
2. Hvilke sikkerhedsforanstaltninger skal der tages ved fjernelse af celler fra flydende nitrogen til genvinding?
Cellekryorør i flydende nitrogen, der ikke er helt forseglede og hvor flydende nitrogen siver ind i sig, kan forårsage en eksplosion, hvis temperaturen i kryorøret stiger kraftigt ved optøning.Det anbefales derfor at bære beskyttelsesbriller og beskyttelseshandsker, når celler fjernes fra flydende nitrogen.Til genoplivning skal fryserøret rystes kontinuerligt i et 37°C vandbad for at optø fryseopløsningen fuldstændigt inden for 1-2 minutter.Tør bagefter rørets yderside af med en spritserviet, tag den ind i det ultra-rene bord og overfør cellerne til et centrifugerør tilsat 10 ml dyrkningsmedium, centrifuger ved 1000 rpm i 5-10 minutter, kassér supernatanten, tilsæt den passende mængde dyrkningsmedium og inokulér dyrkningskolben og inkuber i en 5 % CO2-inkubator.
3. Hvorfor skal celler opbevares i dampfasen af en flydende nitrogentank frem for i flydende fase?
Celler lagret i gasfasen af flydende nitrogen er mere tilbøjelige til at blive genoplivet.Hvorimod i væskefasen af flydende nitrogen, hvis lyofiliseringsrørene ikke er ordentligt forseglet eller har utætheder, kan direkte kontakt mellem cellerne og det flydende nitrogen kompromittere cellernes levedygtighed efter optøning.
4. Hvordan skifter jeg dyrkningsmediet for suspensionsceller?
Dyrkning af suspensionsceller kan udføres ved blot at tilføje frisk medium (hvis plads tillader det) eller ved at adskille cellerne fra det gamle medium ved centrifugering (100 xg i 5 minutter) og efterfølgende resuspendere de udfældede celler i frisk medium.Men for de fleste suspensionscellelinjer er blot tilføjelse af medium en bedre metode.Uanset hvad skal mediet fornyes, før cellerne når deres største mætningstæthed.Cellernes mætningstæthed varierer mellem 3 x 105 og 2 x 106 afhængigt af cellelinjen og dyrkningsbetingelserne (hvile eller omrøring, iltningsniveauer osv.).Celler skal fortyndes til en lavere cellekoncentration for at tillade tilstrækkelig næringsgenvinding til at holde cellerne i logaritmisk vækst.Hvis mediet blot ændres uden at reducere celletætheden, vil cellerne hurtigt udtømme mediet og dø.Hvis cellerne fortyndes under deres mindste tæthed, vil de gå ind i en forsinkelsesfase og vokse meget langsomt eller vil dø.Hver suspensionscellelinje har en forskellig mætningstæthed og passageinterval, så daglige celletællinger er måden at overvåge suspensionscellelinjer*.
5. Hvad er det anbefalede CO2-niveau for cellekultur?
Selvom CO2-niveauer i cellekultursystemer varierer fra 0,03 % til 40 % (typisk omkring 0,03 % CO2 i atmosfæren), er det meget almindeligt, at der ikke er tilsat CO2 til luften eller en CO2-koncentration på 5 % til 10 %.Det er vigtigt at justere koncentrationen af natriumbicarbonat i mediet for at balancere med CO2-niveauet i gasfasen.Celler producerer CO2 og kræver en lille mængde kulsyre for vækst og overlevelse.Hvis der ikke tilsættes CO2, og cellerne formerer sig, kan der anvendes 4 mM (0,34 g/L) vandfrit natriumbicarbonat.Dog skal låget på dyrkningskolben strammes på dette tidspunkt.Hvis dyrkningssystemet kræver 5 % eller 10 % CO2, skal du bruge henholdsvis 23,5 mM (1,97 g/L) eller 47 mM (3,95 g/L) natriumbicarbonat ved 37°C med en initial pH på ca. 7,6.Under disse forhold skal kolben efterlades uden låg, eller der skal bruges en petriskål for at opretholde gasligevægt.
6. Hvorfor har nogle celler brug for natriumpyruvat?Hvor meget natriumpyruvat skal jeg tilføje til mediet?
Pyruvat er en organisk syremetabolit i den glykolytiske vej*, der let kommer ind i og forlader cellen.Derfor giver tilsætningen af natriumpyruvat til mediet både en energikilde og en kulstofkilde til anabolisme, hjælper med at vedligeholde bestemte specifikke celler, hjælper med cellekloning eller er nødvendig, når serumkoncentrationerne i mediet reduceres.Natriumpyruvat hjælper også med at reducere fluorescens-induceret cytotoksicitet.Natriumpyruvat tilsættes sædvanligvis i en slutkoncentration på 1 mM.kommercielt tilgængelige natriumpyruvatopløsninger er sædvanligvis 100 mM opbevaringsopløsning (100X).
Oversat med www.DeepL.com/Translator (gratis version).
Indlægstid: 21-jun-2022