Real-time fluorescens kvantitativ PCR er en metode til måling af den samlede mængde produkt efter hver polymerase kædereaktion (PCR) cyklus i en DNA amplifikationsreaktion ved hjælp af en fluorofor.Metoden bruges til at kvantificere specifikke DNA-sekvenser i prøven, der skal testes ved interne eller eksterne referencemetoder.Siden starten er fluorescerende kvantitative PCR-assays blevet mere og mere populære blandt laboratorielærere.
Fluorescens PCR princip: Fluorescens PCR, først kaldet TaqManPCR og senere også Real-TimePCR, er en ny nukleinsyre kvantificeringsteknik udviklet af PE (PerkinElmer) i USA i 1995. Teknikken er baseret på tilføjelse af en fluorescensmærket probe eller tilsvarende fluorescerende farvestof til konventionel PCR for at opnå dets kvantitative funktion.Princippet: efterhånden som PCR-reaktionen skrider frem, akkumulerer PCR-reaktionsprodukterne, og intensiteten af det fluorescerende signal stiger lige meget.Med hver cyklus opsamles et fluorescensintensitetssignal, så vi kan overvåge ændringen i produktmængde ved ændringen i fluorescensintensitet og dermed opnå en fluorescensamplifikationskurvegraf.
Generelt kan fluorescensamplifikationskurven opdeles i tre faser: fluorescensbaggrundssignalfasen, fluorescenssignalets eksponentielle amplifikationsfase og plateaufasen.Under baggrundssignalfasen maskeres det amplificerede fluorescenssignal af fluorescensbaggrundssignalet, og ændringer i produktmængden kan ikke bestemmes.I plateaufasen stiger amplifikationsproduktet ikke længere eksponentielt, der er ingen lineær sammenhæng mellem slutproduktmængden og startskabelonmængden, og start-DNA-kopitallet kan ikke beregnes baseret på den endelige PCR-produktmængde.Kun i den eksponentielle amplifikationsfase af det fluorescerende signal er der en lineær sammenhæng mellem logaritmen af PCR-produktmængden og startskabelonmængden, og vi kan vælge at kvantificere dette på dette stadium.For at lette kvantificering og sammenligning er to meget vigtige begreber blevet introduceret i real-time fluorescerende kvantitative PCR-teknik: fluorescens-tærsklen og CT-værdien.
Tærsklen er en kunstigt indstillet værdi på fluorescensamplifikationskurven.eksponentiel fase af PCR-amplifikation.
Ct-værdi: er antallet af cyklusser, som fluorescenssignalet i hvert reaktionsrør har gennemgået for at nå den indstillede domæneværdi.
Forholdet mellem Ct-værdien og startskabelonen: undersøgelser har vist, at Ct-værdien for hver skabelon har en lineær sammenhæng med logaritmen af startkopinummeret for den skabelon, jo flere kopier af startkopinummeret, jo mindre er Ct værdi.Ct-værdierne er relativt stabile.En standardkurve kan laves ved hjælp af en standard med et kendt startkopinummer, hvor den vandrette koordinat repræsenterer logaritmen af startkopitallet og den lodrette koordinat repræsenterer Ct-værdien som vist i figuren nedenfor.
Ved at opnå Ct-værdien af en ukendt prøve kan startkopitallet for denne prøve derfor beregnes ud fra standardkurven.
Ct-værdien er ikke konstant og kan påvirkes af forskellige prøver og forskellige instrumenter, selvom den samme prøve gentages 2 gange på det samme instrument, kan Ct-værdien variere.
Kvantitative fluorescensassays: Kvantitative fluorescensassays kan opdeles i fluorescerende prober og fluorescerende farvestoffer afhængigt af de anvendte markører.Fluorescerende prober omfatter Beacon-teknologi (molekylær beacon-teknologi, repræsenteret af amerikanske Tagyi), TaqMan-prober (repræsenteret af ABI) og FRET-teknologi (repræsenteret af Roche);fluorescerende farvestoffer omfatter mættede fluorescerende farvestoffer og ikke-mættede fluorescerende farvestoffer, den typiske repræsentant for umættede fluorescerende farvestoffer er SYBRGreen I, som er almindeligt anvendt nu;mættet Den typiske repræsentant for umættede fluorescerende farvestoffer er SYBRGreenⅠ;mættede fluorescerende farvestoffer er EvaGreen, LCGreen osv.
SYBRGreenI er et almindeligt anvendt DNA-bindende farvestof til fluorescerende PCR, som binder uspecifikt til dobbeltstrenget DNA.I sin frie tilstand udsender SYBRGreenI en svag fluorescens, men når den først er bundet til dobbeltstrenget DNA, øges dens fluorescens 1000 gange.Derfor er det totale fluorescenssignal, der udsendes af en reaktion, proportionalt med mængden af tilstedeværende dobbeltstrenget DNA og stiger, når amplifikationsproduktet øges.
Fordele ved dobbeltstrengede DNA-bindende farvestoffer: simpelt eksperimentelt design, kun 2 primere påkrævet, intet behov for at designe prober, intet behov for at designe flere prober til hurtig test af flere gener, evne til at udføre smeltepunktskurveanalyse, test specificiteten af amplifikationsreaktion, lave startomkostninger, god generalitet og derfor mere almindeligt anvendt i forskning i ind- og udland.
Fluorescerende probemetode (Taqman-teknik): Når PCR-amplifikation udføres, tilføjes et par primere sammen med en specifik fluorescerende probe.Når proben er intakt, absorberes fluorescenssignalet, der udsendes af reportergruppen, af den quenchede gruppe og detekteres ikke af PCR-instrumentet;under PCR-amplifikation (i forlængelsesfasen) nedbryder 5'-3'-spaltningsaktiviteten af Taq-enzymet proben enzymatisk, hvilket gør reporterfluorescensgruppen og quenched fluorescensgruppen
Anvendelser af fluorescerende kvantitativ PCR.
Molekylærbiologisk forskning:
1. Kvantitativ nukleinsyreanalyse.Kvantitativ og kvalitativ analyse af infektionssygdomme, påvisning af patogene mikroorganismer eller vira, såsom den nylige influenza A (H1N1) epidemi, påvisning af genkopi-antal af transgene planter og dyr, påvisning af RNAi-geninaktiveringshastigheder, osv.
2. Differentiel genekspressionsanalyse.Sammenligning af genekspressionsforskelle mellem behandlede prøver (f.eks. lægemiddelbehandling, fysisk behandling, kemisk behandling osv.), ekspressionsforskelle af specifikke gener i forskellige faser og bekræftelse af cDNA-mikroarray eller differentielle ekspressionsresultater
3. SNP-detektion.Påvisningen af enkeltnukleotidpolymorfismer er vigtig for undersøgelsen af individuel modtagelighed over for forskellige sygdomme eller individuel respons på specifikke lægemidler, og på grund af den geniale struktur af molekylære beacons er det let og præcist, når først sekvensinformationen for en SNP er kendt. brug denne teknik til high-throughput SNP-detektion.
4. Methyleringsdetektion.Methylering er forbundet med mange menneskelige sygdomme, især cancer, og Laird rapporterede om en teknik kaldet Methylight, som behandler DNA før amplifikation, så umethyleret cytosin bliver til uracil, og methyleret cytosin er upåvirket, ved hjælp af specifikke primere og Taqman-prober til at skelne mellem methyleret og umethyleret DNA .mere følsomme.
Medicinsk forskning:
1. Prænatal diagnose: Folk kan ikke behandle arvelige sygdomme forårsaget af ændret genetisk materiale, og indtil videre kan de kun reducere antallet af syge babyer født gennem prænatal overvågning for at forhindre forekomsten af forskellige arvelige sygdomme.Dette er en ikke-invasiv metode, der let accepteres af gravide kvinder.
2. Patogendetektion: Det fluorescerende kvantitative PCR-assay muliggør kvantitativ bestemmelse af patogener såsom gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, humant papillomavirus, herpes simplex-virus, humant immundefektvirus, hepatitisvirus, influenzavirus, Mycobacterium tubervirus, Mycobacterium tuber.Det har fordelene ved høj følsomhed, lav prøvestørrelse, hurtighed og enkelhed sammenlignet med traditionelle testmetoder.
3. Lægemiddeleffektivitetsvurdering: kvantitativ analyse af hepatitis B-virus (HBV) og hepatitis C-virus (HCV) viser, at sammenhængen mellem viral belastning og effektiviteten af visse lægemidler.Hvis serumniveauet af HBV-DNA falder under behandling med lamivudin og derefter stiger igen eller overstiger det tidligere niveau, er det tegn på virusmutation.
4. Onkogenetisk testning: Selvom mekanismen for tumorudvikling endnu ikke er klar, er det almindeligt accepteret, at mutationer i relevante gener er den underliggende årsag til onkogen transformation.Øget ekspression og mutation af onkogener kan ses i de tidlige stadier af mange tumorer.Real-time fluorescens kvantitativ PCR er ikke kun effektiv til at detektere mutationer i gener, men kan også nøjagtigt detektere ekspressionen af onkogener.Denne metode er blevet brugt til at detektere ekspressionen af en række gener, herunder telomerase hTERT-genet, WT1-genet for kronisk granulocytisk leukæmi, det onkogene ER-gen, prostatacancer-PSM-genet og tumor-associerede virale gener.
Oversat med www.DeepL.com/Translator (gratis version)
Indlægstid: 21-jun-2022